蛋白质质谱分析具体流程

蛋白质质谱分析具体流程

质谱技术在蛋白质组学中的应用王海龙杨静祁振国岳秀兰(包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头014010；赤峰市第一医院’)中图分类号(}so3 文献标识码A 文章编号1006—740X(2006)02—0231一o3蛋白质组学是后基因组时代的一个新领域，它通过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白质的定量研究，来揭示生命的过程和解释基因表达控制的机理⋯ 。蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Ex·pression Proteomies)和细胞图谱蛋白质组学(Cell MapPmteomies)，前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量图谱，它依赖二维凝胶电泳图谱和图像分析，它能在整体蛋白质水平上研究细胞的通路，以及疾病、药物和其它生物刺激所引起的紊乱，因此它可能发现疾病标志和阐明生物通路；后者是指通过纯化细胞器或蛋白质复合物，用质谱鉴定蛋白质组分，确定蛋白质和蛋白质相互作用的亚细胞位置 】。9O年代以来随着人类基因组计划的实施，引发了生物信息学(Bioinformaties)的发展，使蛋白质分析发生了革命性的变化。现在将高分辨2一维电泳、高灵敏度的生物质谱和快速增长的蛋白质和DNA数据库三者结合起来，为高通量的蛋白质组学(High throughout Proteomies)铺平了道路 。这里主要介绍质谱技术在蛋白质组学中的应用。收稿日期：2006-03-02作者简介：王海龙(1951一)，男。大学，副教授。l 质谱技术的发展历史1．1 质谱的开发历史要追溯到2O世纪初，Thomson创制的抛物线质谱装置，1919年Aston制成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范围也在不断扩大，到2O世纪5O年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。现今质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用更为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。1．2 基本原理质谱(Mass Spectrometry)是带电原子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。质谱仪是一类能使物质离化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质量比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成 。用于分析的样品分子在离子源中离化成具有不同质量的单电荷分子和碎片离子，这些单电荷离子在加1 J 1 J 1"J 1掩JrL rL r L r L维普资讯 http://www.cqvip.com232 包头医学院学报 第22卷速电场中获得相同动能并形成一束离子，进入由电场和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质量比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质量比的离子聚焦在不同的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检测即可得到不同质量比的谱线，即质谱。通过质谱分析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息 J。2 质谱技术种类2．1 电喷雾质谱技术(Electrospray ionization MassSpectrometry，ESI—MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相⋯ 。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用 j。2．2 基质辅助激光解吸附质谱技术(Matrix AssistedLaser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此质谱很合适对蛋白质、多肽、核酸和多糖等大分子的研究。2．3 快原子轰击质谱技术(Fast Atom BomebardmentMass Spectrometry，FABMS) 一种软电离技术，是用快速隋性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适于多肽和蛋白质的分析研究。FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS—MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而使其在生物医学分析中迅速发展起来 ]。2．4 同位素质谱技术是一种开发和应用比较早的技术，被广泛地应用于各个领域，但它在医学领域的应用只是近近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力，该化合物又易于用同位素标示，人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达到检测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了一条思路。3 电泳分离后凝胶上蛋白质的质谱鉴定电泳分离后凝胶上的蛋白质，先用适当的蛋白内切酶酶切成肽段，再用质谱鉴定。现有四种制样方法：3．1 凝胶内酶切凝胶内酶切的灵敏度高，是当前广泛采用的样品制备方法。最常用的蛋白内切酶是胰蛋白酶。它在蛋白质主链精氨酸和赖氨酸的C一端进行切割。文献中有多种凝胶内酶切的方法，这里介绍改进后的Wilm的方法。将电泳后凝胶上的蛋白质斑点以最小的体积切下，并将凝胶块切成约lmm 小颗粒，转入小离心管内，加入约5O 的lOOmmol／L碳酸氢铵溶液洗胶粒5min，弃去碳酸氢铵液，加入50pJ乙腈使凝胶脱水1O一15min。若胶粒未完全脱水再用乙腈脱水～次，弃去乙腈液。将离心管置入真空离心蒸发浓缩器内，微加热15rain使胶粒完全干燥。将50pJ新鲜配制的10mmoVL DTY韵100mmol／L碳酸氢铵溶液加入离心管内，使胶粒水化。在56℃加热30rain还原样品，弃去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微加热干燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙酰胺的100mmol／L碳酸氢铵溶液，烷基化半胱氨酸残基上的巯基。室温暗室中放置20 min，弃去上清夜，加入50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac内干燥。加入2O l胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使胶粒再水化，加入1O一2o 碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，37cI=保温1小时后，放置过夜，所得溶液供质谱分析用。3．2 电洗脱后在溶液中酶解 电洗脱是电泳后从凝胶上回收蛋白质的经典方法。通常蛋白质量多于0．O01 mmol。将含SDS的凝胶与MALDI TOF MS分析结合，可分析亚mmol的蛋白质。Schuh macher等用无SDS pH2．5的乙酸铵作洗脱缓冲液，电洗脱系统的极性相反，蛋白质SDS复合物在原位解离，游离的蛋白质迁移至阴极，用标准蛋白样品实验，回收率达25％～ 56％ [引。3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用于质谱分析，因为它的灵敏度低于凝胶内酶切。电转移时不是维普资讯 http://www.cqvip.com第2期 王海龙，等．质谱技术在蛋白质组学中的应用 233所有的蛋白质都能有效转移，而且在印迹过程中蛋白质可能丢失。另外从PVDF膜上提取酶切后多肽时效率不高，提取时加Triton 100可以增加多肽的提取效率，但去污剂干扰质谱鉴定 J。3．4 印迹过程中酶切 1999年Bins等报道将固定有胰蛋白酶的膜，置于凝胶和PVDF膜之间在印迹过程中使蛋白质样品发生酶切，为了蛋白质完全酶切，印迹过程需要特殊设计。印迹后的膜用基体溶液浸透后可用MALDI TOF MS直接分析。该法的主要特点是印迹过程中平行进行酶切，其灵敏度不如标准方法 J。4 用肽质量指纹谱鉴定蛋白质蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定电泳后凝胶上的蛋白质。质谱技术已取代了生物化学中经典的Edman降解技术¨。。，这是由于质谱技术能进行高通量的分析，能分析蛋白质混合物，而且灵敏。肽质量指纹谱方法最初由Henzel及其同事提出¨ ，很快成为高通量蛋白质鉴定的选用方法。分析时用MALDI TOF MS测定凝胶内酶切后多肽混合物的质量，获得肽质量指纹图谱。蛋白质酶切后生成多肽混合物，可以在蛋白质序列数据库内进行理论预测，并对质谱实测多肽混合物与理论预测的数据进行比较，质谱实测到足够肽段的质量与数据库中一个蛋白质理论预测肽段质量匹配，蛋白质可明确鉴定_1 。随着科学技术的进步，质谱也得到了快速发展，特别是与生物技术的结合，开创了质谱应用的新领域。质谱已成为生命科学研究中非常重要的工具。其研究成果也将大大推动人类基因组的研究，并将使人类对生命的本质，其发生发展过程的认识达到一个前所未有新高度。参考文献[1] 钱小红，盛龙生．生物质谱技术与方法[M]．北京：科学出版社，2003：17．[2] B．N帕拉马克尼．电喷雾质谱应用技术[M]．北京：化学工业出版社，2005：215．[3] 利布来尔．蛋白质组学导论[M]．北京：科学出版社。2005：163．[4] 桑志红．电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用[J]．国外医学．药学分册，2000，27(1)：38．[5] Miller GM，Byrd SE，Kuznieky RI．Nature Insight：FunetionalGenomies[J]．Nature，2000，405：819．[6] 张学敏，魏开华，杨松成．生物质谱和蛋白质组技术的应用策略[J]．分析测试学报，2002，21(增)：9．[7] Weaver RF．Molecular Biology[M]．Columbus：McGraw—Hil1．2001：231．[8] 魏开华，杨松成．转印到膜上的蛋白质的质谱分析[J]．质谱学报，2004：20(3)：89．[9] 夏家辉．医学遗传学[M]．北京：人民卫生出版社，2004：241．[10] Benfey PN，Protopapas AD．Genomies[M]．New Jersey：Prenties Hall。2004：202．[11] 冯作化．医学分子生物学[M]．北京：人民卫生出版社，2001：189．[12] 查锡良．医学分子生物学[M]。北京：人民卫生出版社，2003：263．